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　　1、弹性蛋白(elastin)是以弹性纤维(elastic fibers)为主要成分的一种硬蛋白，在结缔组织的胞外基质中广泛存在。弹性蛋白在调节多种细胞功能中发挥着重要作用，包括促细胞黏附、增殖、分化、趋化和迁移等。弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白(tropoelastin)，在生理条件下，通过赖氨酸氧化酶在赖氨酸残基的选择性氧化，原弹性蛋白经过自凝聚，交联成不可溶的蛋白质，称为弹性蛋白。

　　2、天然的弹性蛋白由两类结构域组成：(1)疏水结构域，富含赖氨酸残基和丙氨酸残基，常以三肽到六肽如ggvp、gvgvp、vpgvg和gvgvap等的重复序列存在；(2)亲水结构域，富含非极性氨基酸。类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，elps)是一类由多个vpgxg(x为除了pro以外的任意一种氨基酸)五肽重复单元串联组成的人工多聚物。目前，存在多种由不同重复单元组成的类弹性蛋白多肽的变异形式，如kggvg，vggvg和lgaggag等形式。

　　3、目前普遍认为，弹性蛋白与细胞的相互租用，主要依靠的是五肽重复序列构成的疏水结构域，研究较多的氨基酸序列有vpgvg，vpgig等。制备带有活性疏水序列的弹性蛋白体系，不仅能为细胞生长提供必需的微环境，同时也能通过优化序列，调控细胞的增殖过程，但是目前现有技术中没有这样的弹性蛋白体系。

　　4、elps具有广泛的使用价值，但是目前elps的质量评价体系还不完善，elps蛋白的产量、表达活性还较低，还没有针对弹性蛋白的商业化标准品。

　　1、本发明的目的在于提供一种重组人源化弹性蛋白及其制备方法。本发明选择人源弹性蛋白疏水结构域的ggvp四肽、gvgvp五肽、gvgagv六肽为重复序列组合成氨基酸组合序列(ggvp)3(gvgvp)1(gvgagv)1，并将此组合序列重复10次，编码形成重组人源化弹性蛋白elps，该重组人源化弹性蛋白具有明显促细胞黏附活性和促成纤维细胞胶原生成活性。

　　2、本发明的另一目的还在于提供一种重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法，其外观、无菌、水分检测均符合规定，在-20℃、4℃、25℃和37℃均能稳定保持24个月的生物学活性。

　　4、一种重组人源化弹性蛋白，所述重组人源化弹性蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

　　5、所述重组人源化弹性蛋白的c端还添加了6个his标签序列和终止子，其氨基酸序列如seq id no:3所示。

　　6、本发明还提供了一种编码所述重组人源化弹性蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

　　8、所述表达载体通过将编码所述重组人源化弹性蛋白的基因通过ecorⅰ和notⅰ的酶切位点插入ppic9k质粒中得到。

　　10、本发明还提供了所述重组人源化弹性蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将所述表达载体电转化至gs115感受态细胞中，培养后获得基因工程菌，基因工程菌经诱导培养、纯化，即制备得到重组人源化弹性蛋白。

　　12、(1)将编码所述重组人源化弹性蛋白的基因通过ecorⅰ和notⅰ的酶切位点插入ppic9k质粒，获得ppic9k-elps质粒，并对其进行线)将线感受态细胞中，培养，即可得到基因工程菌；

　　14、(3)基因工程菌经诱导培养后离心收集上清液，经过滤、纯化得到重组人源化弹性蛋白。

　　15、本发明还提供了所述重组人源化弹性蛋白在制备化妆品或护肤品中的应用。

　　16、本发明还提供了一种重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法，将所述重组人源化弹性蛋白与冻干保护剂混合，经冷冻干燥制备得到。

　　17、所述重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法具体包括以下步骤：将重组人源化弹性蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤，用10mmol/l磷酸盐缓冲液稀释后加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖作为冻干保护剂，进行冷冻线、本发明提供的重组人源化弹性蛋白，选择人源ⅰ型胶原蛋白疏水结构域的ggvp四肽、gvgvp五肽、gvgagv六肽为重复序列组合成氨基酸组合序列(ggvp)3(gvgvp)1(gvgagv)1，并将此组合序列重复10次，j9股份有限公司编码形成重组人源化弹性蛋白elps，并对编码重组人源化弹性蛋白的dna序列进行优化设计，使蛋白肽更适应在毕赤酵母中表达，并将优化设计后的dna序列通过ecorⅰ和notⅰ的酶切位点插入ppic9k质粒，获得ppic9k-elps质粒，并对其进行线性化处理，得到线性化质粒；将线感受态细胞中，培养，得到基因工程菌；基因工程菌经诱导培养后离心收集上清液，经过滤、纯化得到重组人源化弹性蛋白。其生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性，经过体外细胞验证，有明显促细胞粘附活性和促成纤维细胞胶原生成活性。

　　19、本发明提供的重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法，通过将本发明所述的重组人源化弹性蛋白与冻干保护剂混合，经冷冻干燥制备得到，其外观、无菌、水分检测均符合规定，在-20℃、4℃、25℃和37℃均能稳定保持24个月的生物学活性。其可应用于相关重组蛋白生物制品研发、生产和质量评价体系建立，在判定方法的准确度及产品质量控制等方面起到量值溯源和传递作用。

　　1.一种重组人源化弹性蛋白，其特征在于，所述重组人源化弹性蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。2.根据权利要求1所述的重组人源化弹性蛋白，其特征在于，所述重组人源化弹性蛋白的c端还添加了6个his标签序列和终止子，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

　　3.一种编码如权利要求1所述的重组人源化弹性蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seqid no.2所示。

　　5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过将如权利要求3所述的基因通过ecorⅰ和notⅰ的酶切位点插入ppic9k质粒中得到。

　　7.根据权利要求1所述的重组人源化弹性蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

　　9.一种重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组人源化弹性蛋白与冻干保护剂混合，经冷冻干燥制备得到。

　　10.根据权利要求9所述的重组人源化弹性蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述重组人源化弹性蛋白标准品的蛋白质含量为0.80mg/ml。

　　本发明公开了一种重组人源化弹性蛋白及其标准品的制备方法与应用，本发明选择人源弹性蛋白疏水结构域的GGVP四肽、GVGVP五肽、GVGAGV六肽为重复序列组合成氨基酸组合序列(GGVP)3(GVGVP)1(GVGAGV)1，并将此组合序列重复10次，编码形成重组人源化弹性蛋白ELPs，该发明制备的重组人源化弹性蛋白及其标准品具有明显促细胞黏附活性和促成纤维细胞胶原生成活性，可用于重组人源化弹性蛋白产品制备过程的质量控制。

　　技术研发人员：赵俊,凡玉芳,李增,朱何龙,孙同同,许智勇,吴博,何志远

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