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　　本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及致病疫霉分泌的一种激发植物免疫活性的蛋白及其编码基因和应用。

　　疫霉菌是一类重要的植物病原菌，其引起的疫病经常在作物上造成严重的危害。其中由致病疫霉(phytophthorainfestans)引起的马铃薯晚疫病是农业生产中的一种毁灭性病害，造成大量农作物损失[1,2]。19世纪中期，晚疫病在欧洲种植区爆发，连续两年受灾而导致马铃薯绝产，致使几十万人死亡，一百五十万人移居，史称爱尔兰饥馑。目前，晚疫病每年在全球范围内仍造成近百亿美元的农作物损失，依然是威胁人类粮食安全的重大隐患之一[3]。推进马铃薯主粮化是保障我国粮食安全的国家战略，然而晚疫病在我国大部分马铃薯产区均危害严重，是制约我国马铃薯产量的最重要因素之一。

　　效应子是致病疫霉菌向植物细胞输送的一类分泌蛋白，具有调节寄主生理和免疫反应的重要功能，是解析病害发生机制和植物抗病性状的关键[4]。在病原菌侵染植物过程中，植物会利用细胞表面的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,prrs)识别病原菌分泌的效应子，触发植物的基础免疫反应[5]。这些能够激活植物免疫反应的因子通常被称为植物免疫激发子(plantimmunityinducer，pii)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。目前，鉴定病原菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白是国内外研究人员关注的焦点。

　　本发明鉴定到一个新的致病疫霉smallcysteinerich(scr)类效应蛋白pc2，在卵菌中普遍存在，可以被植物识别从而激发植物免疫反应。鉴定致病疫霉分泌的新型植物免疫激活蛋白，研究其与植物互作机理，为开发激活植物免疫的蛋白组生物农药提供有效的蛋白资源。

　　本发明的目的在于提供一种致病疫霉分泌的scr类效应分子pc2，其具有激活植物免疫的活性。

　　本发明的又一目的在于提供上述植物免疫激活蛋白pc2诱导植物免疫活性的最短片段pc2138-198。

　　(b)将seqidno：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激活植物免疫反应功能相关的由seqidno：2衍生的蛋白质。

　　编码上述植物免疫激活蛋白pc2的基因；该基因能够诱导植物抗性，该基因为如下(1)或(2)：

　　(2)与seqidno.1至少具有50％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与seqidno.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与seqidno.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与seqidno.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与seqidno.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与seqidno.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

　　含有pr1信号肽的植物免疫激活蛋白pc2的编码基因，其核苷酸序列如seqidno.3所示。利用本发明的基因编码的氨基酸序列，设计和人工添加pr1信号肽以替换pc2自身信号肽序列，以有利于其在植物中的表达。

　　上述植物免疫激活蛋白pc2具有诱导植物免疫活性的最短片段pc2138-198，其氨基酸序列如seqidno：4所示。

　　含有上述基因或上述肽段pc2138-198的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。所述的重组载体为重组表达载体或过表达载体；所述的重组表达载体是将所述的基因插入植物表达载体pich31160的bsai酶切位点得到的[6]；所述的过表达载体为将所述的基因转入ptor载体得到的。

　　上述的重组表达载体是将所述的基因插入到含有bsai酶切位点、人工添加pr1信号肽以替换基因自身信号肽序列(有利于基因在植物中的表达)的植物表达载体pich31160中得到的。该植物表达载体具体为将基因pc2插入到pich31160::gfp酶切位点bsai中得到的载体pich31160::pc2。

　　上述的包括所述pc2基因在致病疫霉菌中的过表达载体，为ptor载体。利用该表达载体在致病疫霉菌中过表达pc2，获得pc2过表达菌株，以有利于在植物-病原物互作中的应用。

　　上述的植物免疫激活蛋白pc2、上述的肽段pc2138-198、上述的基因、上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

　　pc2能够被植物免疫系统识别产生免疫反应，为提高植物抗性提供了新的途径。最小片段pc2138-198能够诱导植物防卫反应，有望合成有功能的肽段，为生物农药合成提供新的材料。本发明可以运用在定向改造新型有益共生菌、作物育种抗病性改良方面和生物农药等方面，有望提高植物对疫病的抗病性，从而达到增产减药的目的，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

　　图2为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达pc2后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

　　图3为利用植物表达载体在茄科植物注射表达pc2后诱导植物叶片坏死反应检测；

　　图4为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达pc2后诱导烟草叶片活性氧的产生；

　　图5为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达pc2后诱导植物防卫相关基因的表达；

　　图8为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达pc2及其同源蛋白后诱导的烟草叶片过敏反应检测；

　　图9为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达pc2及其同源蛋白后诱导烟草叶片活性氧的产生；

　　图10为检测证实pc2及其同源基因正常表达的sds-page检测图，所用抗体为anti-ha；

　　图11为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达筛选获得pc2诱导坏死反应的最短片段pc2138-198；

　　以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

　　(1)总rna提取：以致病疫霉菌丝体为实验材料，总rna的抽提采用omega公司rna提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其rna含量和质量。

　　(2)反转录生成第一链：取0.7μgrna作模板，根据takara公司primescript反转录试剂盒使用说明进行cdna合成。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆pcr。

　　50μl反应体系：5×buffer10μl，2.5mmdntps4μl,takaraprimerstartaq酶0.5μl,模板cdna1μl，加水至50μl；pcr扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸10min；利用琼脂糖凝胶进行电泳分离，溴化乙锭(eb)染色照相，记录结果，并切胶回收pcr产物。用agarosegeldnapurificationkit(takara)对电泳条带进行回收(该pcr产物条带即为植物免疫激活蛋白pc2基因，送南京金斯瑞公司测序，序列如seqidno.1所示，其所编码的植物免疫激活蛋白pc2氨基酸序列如seqidno.2所示)。切胶回收的pcr产物根据cloneexpressiionestepcloningkit(vazyme)按照说明操作连接到bsai酶切的pich31160::gfp载体上得到含有pich31160::pc2的连接产物。其中载体pich31160::gfp载体为pvx改造载体，含有bsai酶切位点。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞jm109，涂lb(含卡纳50μg/ml)平板，37℃培养16h后菌落pcr验证挑取两个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如seqidno.3。测序正确的质粒电击转化到农杆菌gv3101中，涂lb(含卡纳霉素50μg/ml，利福平50μg/ml)平板，28℃培养48h后菌落pcr验证挑取正确克隆进行后续实验。

　　结果显示，获得植物表达载体pich31160::pc2阳性转化子，其模式图如图1所示。

　　配好的农杆菌用1ml去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、16h光照/8h黑暗)培养。

　　农杆菌注射表达4-5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。烟草叶片放置于紫外成像仪(tanon5200multi)中，在uv光365nm波长下曝光处理，采集照片并使用着色软件tanonimage进行处理。荧光颜色若为黄绿色，证明叶片出现坏死反应，荧光越强，坏死程度越强；荧光颜色若为红色，证明叶片无坏死现象。

　　农杆菌注射表达2.5天后，摘取叶片进行dab染色，观察活性氧的积累。dab染色：称取250mgdab粉末(diaminobenzidine)研磨后溶解于250ml灭菌超纯水中，调节ph值至3.8。将待检测植物叶片浸没于新鲜配制的dab染液中，26℃黑暗静置6～8h。染色完后的叶片浸泡于96％乙醇中煮沸脱色10min，然后将叶片浸泡于乙醇中，25℃，4h后观察拍照。

　　农杆菌注射烟草叶片后，收取不同时间点的样品，提取rna并反转录生成cdna，取适量的反转录产物用于随后的实时定量pcr反应。

　　结果：烟草叶片上瞬时表达pc2及其后，能够诱导植物防卫反应的产生，例如pc2诱导坏死反应的产生(如图2)、活性氧积累(如图4)、防卫相关基因上调表达(如图5)，pc2同源蛋白诱导产生的坏死反应(如图8)及活性氧积累(如图9)等。western检测证实pc2及其同源蛋白能够正常表达(如图10)。

　　配好的农杆菌用1ml去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、16h光照/8h黑暗)培养。

　　农杆菌瞬时表达7-10后，观察叶片的的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片，用相机拍照并保存。

　　结果：pc2能够诱导茄科植物番茄、茄子、马铃薯等的免疫反应，结果如图3所示。

　　利用ncbi数据库及软件seqhunter提取pc2蛋白在卵菌中的同源蛋白序列。

　　利用生物学软件bioedit(版本号7.2.5)进行核酸序列及氨基酸序列的比对；mega7用于基因和蛋白序列的比对以及进化树的构建。

　　结果：pc2蛋白在卵菌中具有高度的保守性，进化树分析和序列比对如图6和7所示。

　　质粒，转化大肠杆菌感受态细胞jm109，涂含有相应抗生素的lb平板(卡纳50μg/ml)，37℃培养16h后菌落pcr验证挑取两个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，其编码的肽段序列如seqidno.4所示。测序正确的质粒电击转化到农杆菌gv3101中，涂含相应抗生素lb平板(卡纳霉素50μg/ml，利福平50μg/ml)，28℃培养48h后菌落pcr验证挑取正确克隆进行后续实验。(2)农杆菌培养

　　配好的农杆菌用1ml去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、16h光照/8h黑暗)培养。

　　农杆菌注射表达4-5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。烟草叶片放置于紫外成像仪(tanon5200multi)中，在uv光365nm波长下曝光处理，采集照片并使用着色软件tanonimage进行处理。荧光颜色若为黄绿色，证明叶片出现坏死反应，荧光越强，坏死程度越强；荧光颜色若为红色，证明叶片无坏死现象。

　　结果：pc2中包含61个氨基酸的片段(138-198)诱导植物免疫反应，结果如图11所示。

　　利用peg介导的原生质体转化技术，将质粒ptor-pc2转入到致病疫霉菌中。利用定量pcr技术筛选获得阳性转化子t8、t14、t29。

　　将生长状态良好的烟草和马铃薯叶片放到接种盘中保湿，接种致病疫霉野生型菌株和pc2过表达菌株。接种5-6天后统计病斑大小并记录。

　　选取接种烟草叶片后0、12、24、36、48小时时间点植物材料用于rna提取与定量pcr反应。

　　结果：致病疫霉pc2过表达转化子侵染烟草、马铃薯能力减弱(图12)，且在侵染过程中能够诱导防卫相关基因nbpr1的上调表达(图13)。

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