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　　蛋白质谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶对豌豆、蚕豆和大豆分离蛋白发酵诱导凝胶化的比较效应

　　豌豆、蚕豆和大豆分离蛋白（PPI、FPI、SPI）正越来越多地被用作开发植物基凝胶（用于奶酪和肉类类似物）的主要原料。一个主要挑战是其有限的功能性，包括低溶解度、差的乳化能力以及受限的分子柔性，这些共同限制了它们形成强且具有内聚性凝胶的能力。因此，需要受控的蛋

　　豌豆、蚕豆和大豆分离蛋白（PPI、FPI、SPI）正越来越多地被用作开发植物基凝胶（用于奶酪和肉类类似物）的主要原料。一个主要挑战是其有限的功能性，包括低溶解度、差的乳化能力以及受限的分子柔性，这些共同限制了它们形成强且具有内聚性凝胶的能力。因此，需要受控的蛋白质修饰和优化的加工条件来定制其凝胶化行为。本研究旨在利用蛋白质谷氨酰胺酶（PG）和转谷氨酰胺酶（TG）修饰PPI、FPI和SPI的凝胶化性质，并评估在乳液基体系中与未来植物基食品应用相关的发酵诱导凝胶化。PG处理导致三种蛋白质的脱酰胺率为12–16%，但仅提高了SPI的溶解度，而ζ电位保持不变，表明净表面电荷变化极小。乳酸菌发酵增强了所有蛋白质的凝胶化，产生46–102 g的凝胶硬度值，并确认酸化是网络形成的主要驱动力。发酵期间添加TG显著增加了所有蛋白质的凝胶硬度（128–402 g），在SPI中观察到最强效果。单独PG处理不影响发酵凝胶的硬度，但以蛋白质特异性的方式调节了TG诱导的凝胶化。在SPI中，PG将TG诱导的凝胶硬度降低至303 g，可能是由于可溶性蛋白质和保水性的增加，而FPI未显示变化，PPI则略有增加至176 g。这些发现强调了PG诱导的脱酰胺与TG介导的交联之间的相互作用，并证明了这些相互作用强烈依赖于蛋白质来源。

　　种子贮藏蛋白因其低碳足迹、低生产成本和支撑全球粮食安全的潜力，正作为动物蛋白的可持续替代品受到日益关注。然而，与动物蛋白相比，种子贮藏蛋白通常表现出较低的功能特性，包括紧凑的球状结构、高分子量和有限的溶解度，导致其在食品体系中性能较差，尤其在高溶解度、乳化、起泡、凝胶化和质构特性方面。此外，植物蛋白常伴有不良感官属性，如豆腥味，进一步限制了其在高质量食品配方中的应用。酶法修饰提供了一种有前景的途径，通过改变蛋白质结构、提高溶解度和增强关键功能特性来克服这些限制。

　　在主要的种子贮藏蛋白中，豆类蛋白（主要来自豌豆、蚕豆和大豆）因其可用性、有利的氨基酸组成和可调节的技术功能特性而被广泛使用。大豆蛋白是研究最深入、商业化最广泛的植物蛋白，而豌豆蛋白和蚕豆蛋白近年因环境可持续性和低过敏风险而备受关注。然而，形成强且一致的凝胶仍是植物蛋白基奶酪和肉类类似物开发中的关键挑战。除了热处理、pH和添加胶凝剂等外在因素，蛋白质的内在特性（如结构、溶解度、粒径和乳化性）显著影响凝胶化行为。不充分的溶解度和大蛋白聚集体会限制蛋白质-蛋白质相互作用，导致凝胶网络脆弱、不均匀；而乳化性不足可能导致乳液凝胶相分离。因此，需要对植物蛋白进行精心选择、靶向修饰和加工。

　　蛋白质凝胶化可通过多种方式诱导，包括加热、酸化和酶交联。其中，酶处理和发酵因其天然、清洁标签的特性而特别有价值。蛋白质谷氨酰胺酶（PG）催化谷氨酰胺残基的选择性脱酰胺，将其转化为谷氨酸，从而增加蛋白质净负电荷，影响溶解度、乳化等功能特性。转谷氨酰胺酶（TG）通过催化谷氨酰胺和赖氨酸残基之间的共价键形成来强化蛋白质网络。乳酸菌（LAB）发酵通过逐渐酸化使pH降至等电点附近，诱导蛋白质-蛋白质相互作用促进凝胶化，同时LAB还产生蛋白水解和胞外多糖，影响微观结构和水合作用。尽管豌豆、蚕豆和大豆蛋白的凝胶化已被独立研究，但实验条件的差异限制了跨研究结果的比较。特别是，在发酵过程中结合PG诱导的脱酰胺和TG介导的交联来生产一致且稳定的植物蛋白凝胶的策略尚未被探索。

　　研究人员假设PG能提高蛋白质溶解度，促进更有效的TG交联，从而在乳酸菌发酵期间协同改善凝胶化。因此，本研究旨在系统研究PG诱导的脱酰胺对豌豆分离蛋白（PPI）、蚕豆分离蛋白（FPI）和大豆分离蛋白（SPI）的影响，并在相同加工条件下评估TG存在时发酵诱导的凝胶化行为。凝胶形成前表征了功能特性（包括溶解度和乳液稳定性），同时评估了凝胶的质构、储能模量G′、微观结构（共聚焦显微镜）和含水量。通过在多种植物蛋白来源上应用相同实验条件，该工作直接比较了SPI、PPI和FPI，以阐明酶修饰发酵凝胶中的结构-功能关系，为高质量植物基食品的理性设计提供关键见解。论文发表在《Food and Bioprocess Technology》。

　　研究人员采用以下关键方法：1）蛋白质脱酰胺处理：将8%（w/v）的PPI、FPI和SPI悬浮液在90°C加热10 min后冷却至50°C，加入5 U/g蛋白质的PG，分别孵育1 h和2 h，随后90°C加热10 min灭酶。蛋白质来源：PPI来自Roquette（法国），FPI来自AGT Poortman（英国），SPI来自IFF（美国）。2）发酵诱导凝胶制备：将PG处理后的蛋白质（6.7% w/w）与菜籽油（6.7% w/w）、蔗糖（1% w/w）和葡萄糖（1% w/w）在水中混合，先用Ultra-turrax匀浆，再用功率超声处理（400 W，24 kHz，脉冲模式）10 min，随后90°C巴氏灭菌10 min，冷却至43°C。加入TG（6.2 U/g蛋白质）和Vega? Harmony发酵剂（含嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等），在43°C恒温箱中发酵20 h。3）凝胶表征：通过穿透测试测定凝胶硬度（Texture Analyser）；通过频率扫描（0.01–10 Hz, 0.1%应变）测定储能模量G′和损耗模量G′′（旋转流变仪）；通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，63×水镜）观察微观结构（尼罗红和快绿染色）；通过干燥法测定含水量；通过Lumisizer?评估乳液稳定性。

　　通过氨基酸分析，PPI、FPI和SPI的谷氨酸/谷氨酰胺和赖氨酸含量相似（153–189 mg/g和51–64 mg/g），表明理论脱酰胺和交联潜力相似，但实际差异由蛋白质结构、残基可及性和网络形成行为决定。

　　**脱酰胺度**：所有PG处理的蛋白质分离物均表现出中等的脱酰胺度，范围在12–16%（PPI约13%，FPI约16%，SPI约14%）。延长处理时间至2 h仅对PPI有轻微增加。

　　**ζ电位**：尽管脱酰胺发生，但在天然pH（~7.0）下所有蛋白质的ζ电位保持不变（PPI: -28 mV, FPI和SPI: -31至-33 mV），可能因初始高负电荷、构象重排或商业蛋白质的潜在预修饰所致。

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　　**溶解度**：PG处理仅显著提高了SPI的溶解度（从80%增至91%），而对PPI（~61%）和FPI（~87%）无显著影响。

　　**蛋白质乳化**：所有乳液的不稳定指数≤0.1，表明高度稳定，PG处理未改变稳定性。功率超声对乳化稳定作用显著。

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　　发酵后所有凝胶pH降至4.2–5.2，PG处理不影响酸化程度。含水量：无TG时82–84%，PG处理未显著影响，但SPI中PG降低了TG处理后的含水量（从79%升至83%），表明PG与TG在SPI中协同改善了保水性。

　　**凝胶质构**：发酵对照中，SPI和FPI形成最硬的凝胶（97–100 g），PPI最软（~46 g）。TG添加显著增加所有凝胶硬度（SPI: 402 g, FPI: 191 g, PPI: 128 g），PG处理单独无影响，但以蛋白质特异性方式调节TG诱导凝胶化：在PPI中硬度增加（128→176 g），FPI中无变化，SPI中降低（402→303 g），后者与SPI溶解度和保水性增加有关。

　　**凝胶流变学**：所有凝胶表现为弹性主导（G′G′′）。TG添加提高了G′，SPI增幅最大（达13,327 Pa）。PG处理单独降低SPI的G′（9,578→3,988 Pa），但不影响硬度，表明PG主要影响线性粘弹性响应。幂律指数（n）分析：无TG时PPI和FPI的n≈0.2–0.3，SPI的n≈0.1；TG添加后所有凝胶n降至~0.1，形成更固体状结构。

　　**凝胶外观与微观结构**：TG处理的凝胶表面更光滑、形状保持更好；SPI凝胶最硬、最光滑。CLSM显示，无TG的PPI凝胶中脂滴较大、分布不均；TG处理使所有凝胶中脂滴更小、更均匀嵌入，表明TG交联形成更强内聚力的网络。PG处理仅引起微小变化。

　　研究结果表明，PG介导的脱酰胺和TG诱导的交联对发酵诱导凝胶化的影响强烈依赖于蛋白质来源。尽管脱酰胺度和氨基酸组成相似，PPI、FPI和SPI在酶修饰后表现出不同的凝胶化性质。PG仅提高了SPI的溶解度，而所有蛋白质的ζ电位在天然pH下保持不变。发酵成功诱导了所有蛋白质的凝胶化，TG添加显著增强了网络，SPI形成最硬、最弹性的凝胶。PG未改变乳液稳定性，但以蛋白质特异性方式调节了TG诱导的凝胶化：略微增加PPI硬度，对FPI影响极小，显著降低SPI硬度。微观结构分析支持了这些趋势，显示TG处理的凝胶（尤其是SPI）具有更内聚的网络和改善的脂质固定化。

　　**结论翻译**：本研究证明了PG介导的脱酰胺和TG诱导的交联对发酵诱导凝胶化的影响强烈依赖于蛋白质来源。尽管脱酰胺度和氨基酸组成相似，PPI、FPI和SPI在酶修饰后表现出不同的凝胶化性质。PG仅提高了SPI的溶解度，而对PPI或FPI在其天然pH（~7.0）下无显著影响。尽管实现了显著的脱酰胺，所有蛋白质在天然pH下的ζ电位保持不变。发酵成功诱导了所有蛋白质的凝胶化，发酵期间添加TG显著增强了网络，SPI形成比PPI和FPI更硬、更弹性的凝胶。虽然PG未改变乳液稳定性，但它以蛋白质特异性方式调节了TG诱导的凝胶化：略微增加PPI硬度，对FPI影响极小，显著降低SPI硬度。微观结构分析支持了这些趋势，显示TG处理的凝胶（尤其是SPI）具有更内聚的网络和改善的脂质固定化。总体而言，这些发现强调了SPI在酶法定制凝胶性质方面具有最大潜力，而PPI和FPI表现出更有限的结构适应性，凸显了在设计用于乳制品和肉类类似物应用的酶修饰植物基凝胶体系时蛋白质来源的重要性。