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　　注射器中实验室（Lab-In-Syringe）自动化样品前处理包含脱蛋白、分析物萃取与溶剂蒸发在线耦合高效液相色谱用于植物基牛奶替代品中水溶性维生素测定

　　溶剂辅助基质沉淀后经离心、上清液分离、溶剂蒸发与复溶，是制备复杂样品基质常用却繁琐的步骤。其自动化尚未在流动分析方法中得到验证，尽管有望节省时间与耗材并提升方法重现性。为解决这一挑战性问题，研究人员开发了注射器内实验室（Lab-In-Syringe）自动化方法

　　溶剂辅助基质沉淀后经离心、上清液分离、溶剂蒸发与复溶，是制备复杂样品基质常用却繁琐的步骤。其自动化尚未在流动分析方法中得到验证，尽管有望节j9.com省时间与耗材并提升方法重现性。为解决这一挑战性问题，研究人员开发了注射器内实验室（Lab-In-Syringe）自动化方法并在线耦合高效液相色谱（HPLC），用于测定植物基牛奶替代品（燕麦、大豆、榛子、杏仁和椰子奶替代品）中的水溶性维生素B?、B?、B?、B?、B?和B??。研究人员利用自动注射泵实现盐助均相液液萃取（Salting-out-assisted Homogeneous Liquid–Liquid Extraction, HLLE）自动化，同时使蛋白质变性并将沉淀基质从燕麦、大豆、榛子、杏仁和椰子奶替代品中分离。有机相被送入二级耦合自动注射泵，该泵使用预热空气进行溶剂蒸发。据研究人员所知，这是首次在流动技术中结合完全自动化基质沉淀与溶剂蒸发的报道。由此，与早期报道的注射器中脱蛋白相比，分析物浓度显著提升，早期方法为实现与HPLC兼容需显著稀释萃取液。突出特点包括亚毫升级样品体积、总处理时间仅9分钟（含中间系统清洗），以及与样品处理并行进行的萃取液在线耦合HPLC-UV分析，样品通量达5个/小时。实现了满足常规分析的足够分析性能：定量蛋白消除、定量限（LOQs）为0.5–2.7 μg/L、相对标准偏差（RSDs）为1.1–2.6%（不使用内标时

　　研究背景方面，水溶性维生素是人体必需微量营养素，需持续摄入，植物基牛奶替代品常强化维生素以满足营养需求，但其基质复杂（高蛋白质、脂质），传统溶剂辅助脱蛋白需离心、过滤、手动溶剂蒸发等繁琐步骤，易引入变异、耗时耗耗材，且现有自动化方案（如机器人系统、固相萃取SPE）成本高或依赖耗材，流动分析中尚未实现脱蛋白与溶剂蒸发全自动化，此前注射器中实验室（Lab-In-Syringe, LIS）虽可实现无离心脱蛋白，但需大幅稀释萃取液以兼容HPLC，灵敏度受限。因此研究人员开展双LIS系统全自动前处理（盐助均相液液萃取HLLE耦合在线溶剂蒸发）在线耦合HPLC-UV研究，测定植物基牛奶替代品中B族维生素，结论为该方法实现完全自动化脱蛋白与溶剂蒸发，提升分析物浓度、重现性与通量，适用于复杂基质常规分析，发表于《Advances in Sample Preparation》。

　　关键技术方法：采用双LIS系统（两台自动注射泵，SP-XL直立用于HLLE脱蛋白，SP-XC倒置用于溶剂蒸发），通过8端口选择阀（SV）与流路连接；盐助HLLE以4.5 mol/L (NH?)?SO?为盐析剂、ACN:丙酮（1:1）为萃取/变性溶剂、pH 6.5磷酸缓冲液调节样品；溶剂蒸发通过SP-XC内预热空气流（流速分步120–600 mL/min、温度≤40°C）实现；在线耦合HPLC-UV使用YMC-Triart C18柱（4.6 mm id×100 mm, 5 μm）、梯度洗脱（10 mmol/L磷酸缓冲液pH 4.7为A相，甲醇为B相），检测波长对应各维生素吸收最大值；样本为市售燕麦、杏仁、榛子、大豆、椰子植物基牛奶替代品（脂肪含量0.9–1.9%），开封后4°C保存5天内使用。

　　3.1 色谱方法开发：筛选Symmetry C18、Ascentis PFP、Triart C18、Luna Omega Polar C18柱，选Triart C18（对极性碱性化合物保留稳定、宽pH兼容）；缓冲液选磷酸（低UV吸收），pH 4.7实现所有分析物完全分离；有机相选甲醇（氢键去除残留脂质、基线% B清洗柱，避免共萃取脂质影响，无需额外离线 脱蛋白与溶剂蒸发的LIS装置：单LIS存在死体积极取有机相困难或沉淀污染，故用双LIS——SP-XL直立行HLLE脱蛋白，SP-XC倒置行溶剂蒸发（可完全排空至气垫）；SP-XC气流分步提升（120→600 mL/min）避免暴沸拖出液滴，温度≤40°C无安全隐患，冷却盘管捕集冷凝溶剂无挥发。

　　3.3.1 萃取pH与中间清洗：加50 μL 2 mol/L磷酸缓冲液pH 6.5（分析物中性、抗氧化），5% NH?OH in 异丙醇有效溶解脂质与重悬蛋白flake（玻璃壁与蛋白负电排斥，活塞擦拭增强清洗）。

　　3.3.2 盐析剂与相比选择：对比2 mol/L MgSO?+1 mol/L NaCl与4.5 mol/Lj9.com (NH?)?SO?，(NH?)?SO?有机相回收率更高（105% vs 120%）、萃取更透明，选(NH?)?SO?。

　　3.3.3 脱蛋白溶剂选择：纯ACN蒸发慢、重现性差，ACN:丙酮1:1混合蒸发速率适中（沸点更低、蒸气压更高），HLLE效率相当（有机相回收115% vs 105%），选1:1混合。

　　3.3.4 蒸发条件研究：纯ACN 4分钟剩32.5%、6分钟剩15%，易溅出；ACN:丙酮1:1混合4分钟剩约16%（6倍预浓缩），选1:1混合、蒸发4分钟（含SP-XL清洗1分钟），蒸发后萃取液与水1:1稀释（避免峰展宽）。

　　3.3.5 残留蛋白评价：Pierce BCA蛋白试剂盒测真实样品，纯ACN脱蛋白残留

　　3.3.6 搅拌速率：≥1300 rpm减小蛋白团聚、延长分相，≤900 rpm混合不足，1100 rpm时分相最快、蛋白层压实最佳，峰面积差异仅约16%。

　　3.3.7 加盐后搅拌与分相时间：加盐后搅拌10秒已均质，延长时间无改善；分相时间因基质异：大豆、燕麦、椰子40秒完成，杏仁、榛子需100秒，统一选100秒；蛋白层位置因密度异，固定转移有机相体积800 μL（留1400 μL顶空气防液滴拖出）。

　　3.3.8 其他基质共萃取：200 nm监测共萃取组分（主要为脂质），椰奶萃取液基线最干净（脂肪最低）；NH?OH-异丙醇清洗去除吸附于蛋白与PTFE壁的脂质，10 μL进样基质信号可忽略，无背压升高或残留。

　　3.3.9 适用进样体积：蒸发后残留丙酮在3分钟附近有大峰，进样≥25 μL峰分辨恶化，选10 μL（丙酮峰与分析物分离、峰形良好）。

　　3.3.10 在线耦合HPLC转移体积优化：排尽蒸发后顶空气再吸稀释水与室温空气推送萃取液至进样阀，10 μL进样体积下转移体积300 μL时峰面积重现最大。

　　3.4 方法验证与实际样品分析：按AOAC指南验证——线.2–0.9 μg/L、定量限（LOQ）0.5–2.7 μg/L，日内RSD 1.1–2.6%、日间RSD 1.7–2.6%，准确度（回收率）90.9–111%；真实样品（五种植物基奶）本底B?、B??可测（B??约3.8 μg/L、B?杏仁/榛子/大豆/燕麦约2.1 mg/L、椰奶

　　3.5 植物基牛奶替代品样品分析应用：五种样品加标回收率——B?-酰胺86.9±12.5%、B?100.6±12.2%、B?91.7±7.3%、B?-酸77.2±7.2%、B?93.0±7.6%、B??92.4±8.2%、B?92.9±4.3%；内标信号RSD 2.8±1.8%，无内标重现性仍满足常规分析；基质脂肪/蛋白含量未显著影响回收率，方法适用于不同植物源复杂基质。

　　3.6 方法性能讨论与对比：对比传统离心脱蛋白（耗时

　　30分钟、易分析物吸附损失）、半自动SPE（耗材贵、柱堵塞）、超滤（膜吸附、背压高难低压自动化）、酶解（耗时昂贵），双LIS-HLLE全自动化、无手动离心/过滤/换柱、样品体积

　　1 ml、总处理9分钟、通量5/h、loq可比光学检测hplc、此前lis脱蛋白需稀释7倍，本研究通过蒸发预浓缩抵消稀释、提升灵敏度；双lis复杂度高于单lis，未来可探索更简单蒸发（如透汽膜、微流控喷雾）或磁珠脱蛋白、缩小规模耦合自动进样器。

　　5%（无内标），满足常规监测；首次实现流动技术中全自动基质沉淀+溶剂蒸发，为复杂液体食品/生物基质微量营养素分析提供自动化方案。