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　　植物中的冰核（ice nucleation，内在和外在）是一个广泛的研究课题，涵盖避免和耐受策略。本综述聚焦于针对晚春霜冻（late spring frosts）的避免策略，随着气候变化变得更加极端，晚春霜冻将越来越多地影响果树和草本植物。大多数主动防霜冻方法

　　植物中的冰核（ice nucleation，内在和外在）是一个广泛的研究课题，涵盖避免和耐受策略。本综述聚焦于针对晚春霜冻（late spring frosts）的避免策略，随着气候变化变得更加极端，晚春霜冻将越来越多地影响果树和草本植物。大多数主动防霜冻方法依赖于喷灌、加热器和风扇，但这些做法通常昂贵、对环境有害，或在某些冰冻条件下可能失效。在此，研究人员回顾并评论了替代性喷雾策略（spray-based strategies）的功效，包括杀菌剂（bactericides）、绝缘体（insulators）、冷冻保护剂（cryoprotectants）、冰核抑制剂（ice nucleation inhibitors）、生物刺激素（bio-stimulants）、抗蒸腾剂（anti-transpirants）和疏水膜（hydrophobic films）。调整参与角质层（cuticle）发育的激素和遗传因素，也可能通过阻断外在冰核形成并防止损伤，使活跃生长的植物更具抗冻性。角质层是许多非生物和生物胁迫的第一道防线，加强这一屏障以抵抗多重胁迫应进一步研究。

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　　2. 疏水性与避免结冰（Hydrophobicity and freezing avoidance）

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　　角质层蜡（cuticular wax）参与许多物种抵抗结冰事件的能力。例如，从小麦穗部去除角质层蜡会降低在?3?°C辐射霜冻事件下的存活率和过冷能力（supercooling）。在树木中，如欧洲赤松（Pinus sylvestris），蜡质降解与抗冻性和抗旱性下降相关。叶片疏水性（hydrophobicity）的增加通过从叶片表面去除露水来降低外在冰核（extrinsic ice nucleation）的概率。疏水性通过测量水滴与植物组织表面之间的接触角（contact angle）来评估：接触角0°–89°为亲水性（hydrophilic），90°及以上为疏水性（hydrophobic），150°–180°为超疏水性（superhydrophobic）。海拔与植物叶片疏水性之间存在正相关，热带植物叶片通常为亲水性，而高山叶片高度疏水（130°–150°），表明该性状可能对霜冻常见地区的植物生存很重要。在生长室中培养的半高山环境拟南芥（Arabidopsis helleri）茎生叶平均接触角大于110°，而低地植物小于110°。半高山植物还具有密集的毛状体（trichomes），而低海拔植物无毛。田间采集的半高山拟南芥叶片中烷烃（alkanes，C29、C31、C33）和初级醇（primary alcohols，C26和C28）浓度高于低海拔植物。在生长室中培养时，高山植物比低地植物具有更高的烷烃浓度，且在湿（有核）冷冻试验中损伤更少；而干冻时群体间无差异。密集的三维蜡质晶体或毛状层可在表皮细胞与发育中的冰晶之间形成保护性气穴，并有效去除液态水，防止其在角质层上结冰。形成超疏水层的蜡质晶体还可减少水滴滴向叶片的热传递，从而延迟角质层上水的冻结。此外，厚角质层在某些常绿植物中可作为冰晶生长的屏障，但大多数草本植物中不存在此特性。在极低露点温度的干春霜（dry spring frost）条件下，即无露水或冰晶形成时，蜡质晶体不太可能提供保护，冻结将取决于内在核化剂（intrinsic nucleators）和内部屏障。

　　拟南芥中的转录因子减少蜡质生物合成（Decrease Wax Biosynthesis，DEWAX）是蜡质生物合成基因（包括CER1、参与合成角质和蜡质前体酰基-CoA的长链酰基-CoA合成酶2（LACS2）、脂肪酸延长酶复合体组分的烯酰-CoA还原酶（ECR）以及负责合成胞质乙酰-CoA的ATP-柠檬酸裂解酶A-2（ACLA2））的负调控因子。DEWAX2（拟南芥中DEWAX的同源物）也被证明可下调LACS1、LACS2、3-酮脂酰-CoA合酶11（KCS11）和CER1的表达。dewax和dewax2突变体在拟南芥中表现出总蜡质负荷增加。在拟南芥中过表达甘蓝型油菜（Brassica napus）的BnaC9.DEWAX1导致C29烷烃、C29酮、C29次级醇及总蜡质产量降低。有趣的是，在干旱和冷（4?°C）条件下，甘蓝型油菜叶片组织中BnaC9.DEWAX1的表达降低，表明该转录因子可能参与多重胁迫抗性途径。拟南芥dewax突变体表现出增强的过冷能力，与野生型和cer3植物相比在更低的温度下开始结冰，并对脱水失水表现出更强的抗性。在拟南芥中异源过表达蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的蜡质产量1（Wax Production 1，MtWXP1）和MtWXP2分别使植物更抗冻和更不抗冻。两种转基因系的蜡质负荷主要通过正烷烃浓度增加，但与野生型相比，MtWXP1-ox中初级醇增加，MtWXP2-ox中减少。过表达另一个转录因子拟南芥MYB结构域蛋白96（AtMYB96）被发现正调控脂质转移蛋白3（LTP3），并同时提高抗旱性和抗冻性。目前尚不清楚蜡质负荷增加或蜡质组成变化如何使植物更抗冻，可能是这些植物避免了更长时间的冰核形成导致损伤减少，或这些转录因子具有其他下游途径或生长畸形增加了抗冻性。

　　尽管春霜是春季的主要胁迫，但果树（与田间条件下生长的所有作物类似）常暴露于多种胁迫中，不同年份不同胁迫更为突出。因此，如果角质层可提供多重胁迫保护，选择或上调特定关键成分将提供战略优势。在冷胁迫条件下，植物常表现出角质层蜡质沉积的变化，这作为防止失水和脱水的保护屏障。在玉米中，秋季初霜前的低温显著降低了角质层的疏水性，敏感品系比抗性基因型受影响更大。角质层的数量和组成均发生变化。在小麦中，蜡质晶体的形态和数量在不同干旱胁迫条件下存在差异，并因干旱敏感与抗性品种而有差异诱导。响应冷胁迫的角质层蜡质生物合成调控涉及由多种调控因子及相关生物合成途径介导的复杂转录和转录后机制。Rahman等人发现蜡质生物合成基因CER3和CER1以及蜡质合成负调控因子DEWAX同时参与避霜和抗脱水。cer3-6和cer1-4突变体在脱水胁迫期间对离体枝条失水更为敏感。此外，cer3-6在冷驯化期间维持蜡质沉积的能力受损，这与亚零度条件下对冻结的高度易感性相关。此前，黄瓜中CER3的同源基因CsWAX2受干旱、脱落酸（ABA）、低温和盐胁迫诱导。与野生型相比，过表达CsWAX2的黄瓜植株在抗旱性和抗灰霉病（Botrytis cinerea）方面显著改善。在拟南芥的极端耐盐近缘种盐芥（Thellungiella salsuginea）中，冷胁迫下角质层相关基因表达变化也得到广泛研究。在4?°C条件下，盐芥中CER1和CER3分别上调164%和372%。其他在4?°C下上调的蜡质生物合成基因包括KCS1、KCS2、KCS6、LACS2和CER4。许多调控蜡质生物合成的调控基因在冷胁迫下发生改变，包括MYB96、MYB94和MYB30。MYB96（诱导蜡质生物合成基因）表达显著增加（142%），而MYB30和MYB94在4?°C下略有增加。此外，参与蜡质脂质输出的基因（包括ABC转运蛋白G家族成员11（ABCG11）、ABCG12/CER5、ABCG13、ABCG32/PEC1、ABCG6、非特异性脂质转移蛋白GPI锚定1（LTPG1）和LTPG2）的转录本丰度更高。在甘蓝型油菜中过表达CER1直系同源物导致角质层蜡质增加，从而提高抗旱性。此外，在拟南芥中蜡质含量增加不会影响角果或种子数量。这些结果共同强调了CER1和CER3基因在植物中的进化保守性，突出了它们在蜡质生物合成及调节包括避霜在内的多种胁迫抗性中的关键作用。在盐芥中，4?°C条件下DEWAX表达水平降低。同样，甘蓝型油菜的四个DEWAX直系同源物在冷驯化温度（15?°C/5?°C，昼/夜）下表达降低。此前，Wang等人功能鉴定了甘蓝型油菜中DEWAX的一个直系同源物BnaC9.DEWAX1，发现其表达受冷、干旱、脱落酸（ABA）和茉莉酸下调。过表达BnaC9.DEWAX1部分拯救了拟南芥dewax突变体的表型。这些数据表明DEWAX介导的蜡质生物合成调控可能在植物抵抗多种环境胁迫中发挥关键作用。

　　在植物进化史中，由植物激素脱落酸（ABA）介导的激素信号与角质层同时出现在早期陆地植物中。ABA生物合成和信号通路在植物适应多种环境胁迫中发挥关键作用，并参与角质层形成和通透性的调控。外源10–100 μmol/L ABA喷雾处理使拟南芥角质层蜡质积累增加27%–90%。蜡质生物合成及相关调控基因（包括CER1、CER3、CER4、CER5、LACS1、LACS2、三型基因异常诱导1（ATT1）和MYB30）的表达受ABA诱导。拟南芥中ABA缺陷和不敏感突变体在角质层发育方面受损，通常比亲本基因型具有更通透的角质层。与野生型相比，具有更通透角质层的突变体在脱水条件下更易失水，且在亚零度温度下更易冻结，如cer3突变体所示。ABA缺陷突变体中诱导蜡质生物合成基因的主要调控基因（如MYB96和MYB94）表达降低。DEWAX在ABA缺陷突变体中的表达也增加；因此，ABA信号似乎通过降低DEWAX表达并增加角质层生物合成正调控因子MYB16、MYB94和MYB96的表达来促进角质层生物合成。长期以来已知ABA在植物冷胁迫抗性中发挥作用。还观察到叶面喷施ABA可通过促进休眠和降低芽含水量来增加田间葡萄的抗冻性。乙烯（ethylene）已知可调控表皮蜡质，在柑橘中将蜡质代谢转向初级醇合成并改变角质层通透性。在苹果中，乙烯改变角质层蜡质的组成。乙烯还通过改变甘蓝型油菜不同基因型中的蜡质含量和组成来影响角质层蜡质沉积。乙烯对果实采后贮藏性的影响已引发大量研究，但主要集中在角质层通透性和失水方面，对霜冻的研究很少。鉴于乙烯对角质层蜡质代谢、组成和通透性的显著影响，评估其对增加或减少避霜性的影响将具有价值。

　　植物表面的冰核活性细菌（ice nucleation-active bacteria, INA bacteria）产生大型细菌膜结合蛋白，导致水在比不存在时更高的温度下结冰。例如，当施加含INA细菌的水滴时，桃花在约?3?°C结冰，而不含INA细菌的花在约?3至?4.2?°C结冰。某些细菌可能在高达?1.5?°C时启动核化。使用铜基喷雾剂及其他杀灭细菌菌落（如丁香假单胞菌 Pseudomonas syringae）的杀菌剂可降低叶片上水的冰点，使植物过冷至更低温度。然而，使用杀菌剂预防霜冻有许多缺点。田间条件下无法完全消除INA细菌，因此需要频繁施用，因为细菌分裂迅速，且杀菌剂需提前施用以便INA蛋白降解。真菌、昆虫以及含有生物残留的土壤尘埃也可诱导冰核。此外，在具有相对温暖亚零度温度下活跃的内在核化剂的植物中，保护程度降低。例如，桃树芽的冰核剂可能不与细菌相关，而是与内在核化剂相关，因为核化剂（1）在田间和温室生长的植物中均存在；（2）与越冬休眠组织及整个花发育相关；（3）对表面消毒剂有抗性；（4）对细菌核化有抗性；（5）可被高压灭菌灭活。他们还强调，评估核化活性时组织大小至关重要，因为小样本可能不含足够的核化剂。杀菌剂喷雾功效的报道不一。“Frostgard”（AgXplore International，美国）具有杀菌特性，可降低溶液中INA细菌的核化温度，但在葡萄叶片组织上仅显示有限的保护效果至?2?°C。当每周施用铜杀菌剂时，田间马铃薯在?4?°C辐射霜冻后受伤枝条比例降低。该喷雾对枝条数量较少的植物更有效，因为枝条间冰传播风险降低。其他研究表明，通过喷洒杀菌剂或施用竞争性非INA细菌减少INA群体，可在扁桃、脐橙、梨和玉米中实现防霜冻。

　　泡沫已成功用于低矮、高价值作物，提供高达9?°C的绝缘效果。明胶和糖基泡沫可持续长达8天，可生物降解且无植物毒性。专用喷雾器和霜冻后去除多余泡沫的需求限制了其大规模应用。此外，降水和风会降低其有效性，泡沫可能需要完全覆盖植物侧面以支撑并防止因泡沫重量而弯曲。使用泡沫保护果树很困难，因为树冠通常无法支撑连续的泡沫层。涂有泡沫的柠檬树在霜冻期间未得到充分绝缘，但当泡沫与热源结合使用时，绝缘效果是单独热源的两倍。植物基分散体，如纤维素纳米晶（cellulose nanocrystals）、纳米纤维（nanofibrils）及其他植物源多糖，已被应用于果树形成亲水薄膜以绝缘芽并提高其抗冻性。纤维素纳米晶膜具有极低导热系数（0.061 W/m K），因其纳米级空气填充孔。用3%纤维素纳米晶膜涂覆的苹果芽内部结冰温度比未涂覆芽低5.5?°C以上。用2%纤维素纳米晶溶液涂覆的桃芽抗冻性比未涂覆芽高0.9?°C，并延迟冰核约28分钟。在这两项研究中，冻结试验均未施加外部冰核剂。田间试验中，降水减少或消除了纤维素纳米晶膜的有效性，这限制了其在干燥春季条件下延迟冻结的应用。与沉积霜相比，纤维素纳米晶膜在冻结前叶片表面有露水湿润的霜冻中效果可能较差。开发一种疏水性或更耐水的绝缘喷雾将是有益的。海藻酸钠膜因其绝缘和冰点降低特性也被提议作为植物防霜冻剂，但目前仅进行了涉及冷耐受性、休眠延长等研究。棉花糖涂层（加或不加稻草）也被测试作为绝缘体以减少葡萄藤枝条上的冻害。该方法难以应用于植物，且在实验室条件下持久性非常有限，因其具有吸湿性且会坍塌。物理覆盖物如聚丙烯薄膜可有效保护马铃薯和黄瓜幼苗免受霜冻。这些覆盖物形成防水小气候，增加春季凉爽天气下的空气和土壤温度。它们可拆卸存放并重复使用长达三个季节。当田间条件凉爽或收获较早时，使用覆盖物在马铃薯生产中具有成本优势，但该方法劳动强度大，且除高价值作物外可能不适用于大规模商业种植。

　　“FreezePruf”（Liquid Fence，美国）是一种基于聚乙二醇（冷冻保护剂和细胞膜稳定剂）、甘油（冷冻保护剂）、硅酸钾（细胞壁增强剂）、硅聚醚（表面活性剂）和抗蒸腾剂的商业产品。该喷雾在实验室条件下为多种测试植物和组织提供2.2–9.4?°F的冷耐受保护。然而，一个外部实验室团队评估了“FreezePruf”的有效性，发现涂覆与未涂覆植物或组织在过冷或抗冻性方面无益处。冻结方法的差异可能产生相反结果，但商业喷雾应能在多种冻结条件下有效。两项研究均分析了干燥、涂覆植物的冻结，因此需要一项研究，在冻结前对涂覆植物喷洒核化剂。聚乙烯醇微粒也已用作喷雾保护植物免受霜冻，因其通过弱结合冰晶表面来阻止冰晶生长。其机制类似于抗冻蛋白（antifreeze proteins），但结合是弱且可逆的，而许多抗冻蛋白的结合是强且不可逆的。当喷洒在休眠樱桃芽上时，在?5?°C暴露4小时后，花原基损伤平均减少约55%。实验室冻结试验中植物处于干燥状态，田间冻结试验显示良好效果。抗冻蛋白还可通过使冰核剂失活，导致水溶液过冷至更低的亚零温度。表达抗冻蛋白可使植物过冷至更低温度。例如，在质外体中组成型表达甲虫抗冻蛋白的拟南芥在低2–3?°C的温度下结冰。在冷驯化的二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中敲低抗冻蛋白基因，导致有核叶片比野生型冷驯化植物在约1–2?°C更高的温度下开始结冰。抗冻蛋白还可能通过直接蛋白质-蛋白质结合，在某些植物物种中作为防御机制对抗INA细菌蛋白，从而降低植物的核化温度。

　　“Antifrost”（Cropaid International Ltd.，英国）声称可增加植物抗冻蛋白和糖蛋白的产量，以减少或防止冰核。在开心果中，施用生物刺激素（包括Cropaid、Tiofer和Bio-Bloom）增加了脯氨酸、抗氧化酶和光合色素的浓度，但未报告这些化合物对避霜或耐受性的功效。在冻结处理后测量冷损伤程度将很有趣。对于敏感草本植物的保护，避霜而非耐霜可能是更好的策略，因为一旦冰进入植物，就会发生损伤，且植物提高抗冻性的能力有限。“Basfoliar Frost Protect”（Agricare，印度）含有α-生育酚、乙二醇和硼，可将扁桃幼果的LT50降低0.5?°C，扁桃花降低2.5?°C。另一项研究将多种喷雾剂（包括“国光抗秀”（活性成分ABA）、“Ice Shield”（水杨酸、海藻糖、氮、磷、钾）以及“Biogas Liquid”和“SenHuo”（均含腐殖酸、氮、磷、钾））施用于葡萄藤。1或2天后，剪取枝条并在?2?°C冷冻1.5小时。与喷水对照相比，这些喷雾剂增加了渗透势和抗氧化剂含量，从而降低了电解质渗漏并增加了冷冻处理后的叶绿素荧光。在这两项研究中，尚不清楚损伤指标的降低是由于避霜还是耐霜机制，因为未测试冰核温度。在田间霜冻事件前向整株植物喷洒生物刺激素的功效需进一步研究。

　　一种疏水煅烧高岭土（M96-018）膜已在3%和10% w/v浓度（分散于10%甲醇和90%水溶液中）下测试用于避霜。3%高岭土膜在施加含INA细菌的水滴后延迟了叶片的核化，并持续减少了马铃薯、葡萄和柠檬植物中受损枝条的百分比。在第二项研究中，涂覆10%疏水颗粒膜的番茄小叶过冷至?6?°C或更低，而未涂覆叶片约?3?°C，丙烯酸聚合物涂覆叶片约?3?°C。当盆栽植物移至室外自然辐射冻结事件中时，大多数高岭土涂覆植物存活，而几乎所有未涂覆植物死亡。该技术已获专利，但未商业应用，因为喷雾易剥落、覆盖不均匀且难以分散于甲醇中。对该配方的进一步改进可能产生一种有前景的喷雾，可在辐射霜冻下应用于敏感植物组织。最近，在?2和?2.5?°C可控冻结试验中，涂覆疏水高岭土-壳聚糖基涂层的菜豆植物损伤比未涂覆植物减少。但作者指出，由于分散体粘稠且难以完全涂覆植物，冻结试验中变异性较大。

　　抗蒸腾剂如“Anti-stress 550”（Polymer Ag LLC，美国）声称通过在角质层上形成屏障减少水分流失并保护植物免受冰晶，提供约2–3?°C的冷保护。声称能保护植物免受霜冻的产品需有充分证据支持，并说明喷雾有效的持久性和条件。当“Anti-stress 550”施用于马铃薯、葡萄和柠檬植物时，与未涂覆对照相比，损伤相同或更大。在该研究中，冻结前对植物喷水。在一项田间研究中，两种商业产品——冷冻保护剂“FrostFree”（Plant Products，美国）和抗蒸腾剂“Vapor Gard”（Miller Chemical and Fertilizer，美国）——被施用于辣椒和番茄植物以保护其免受春季和秋季霜冻，但未观察到任何霜冻事件下的保护效果。相反，喷洒“Anti-stress”的鳄梨树在?2.3?°C霜冻后轻度叶片损伤比喷水对照减少。许多其他喷雾剂未说明成分、作用模式和/或缺乏适当的科学测试。例如，“ThermoMax”（BdMax，新西兰）声称可将植物内部温度提高0.7–2.0?°C，但提高温度的机制尚不明确。该产品含有缬草、蒲公英和洋甘菊的顺势疗法稀释液，因此由于保护性化合物浓度低，可能不会产生保护效果。种植者在选择产品应用于作物时需极为谨慎，并选择经过科学测试的产品。

　　晚春霜冻的风险在我们变暖的气候下反而增加，使从果树到大田作物的广泛作物面临更大风险。这凸显了对有效避霜策略的需求，这些策略应超越传统的、资源密集型保护方法。尽管已使用多种喷雾方法，包括杀菌剂、绝缘体、冷冻保护剂、生物刺激素、抗蒸腾剂和疏水膜，但效果参差不齐。功效常因霜冻类型、环境条件和植物物种而不一致。相比之下，通过遗传、激素或生化途径增强植物角质层提供了一种更持久、多层面的方式，以降低外在冰核形成并提高抗冻性。由于角质层提供针对多种非生物和生物胁迫的综合保护，对蜡质生物合成及其调控因子的靶向操作可能为开发具有广泛抗逆性的作物提供有力策略。推进这一研究方向对于在日益多变的气候中减轻霜冻及其他胁迫至关重要。