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　　摘要翻译：替代性动物蛋白生产途径对于减少对传统畜牧业依赖至关重要，后者显著贡献于温室气体排放、森林砍伐和水资源消耗。肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是脊椎动物肌肉中发现的一种重要的携氧血红素蛋白，能够增强肉类的营养和感官特性。由于其独特的功能性，Mb已在多

　　摘要翻译：替代性动物蛋白生产途径对于减少对传统畜牧业依赖至关重要，后者显著贡献于温室气体排放、森林砍伐和水资源消耗。肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是脊椎动物肌肉中发现的一种重要的携氧血红素蛋白，能够增强肉类的营养和感官特性。由于其独特的功能性，Mb已在多种生物中异源表达，尽管在高等植物中仅报道过本氏烟（Nicotiana benthamiana）中的瞬时表达。在本研究中，研究人员利用叶绿体转化技术在高等植物（烟草，一种非食用模式植物；生菜，一种可食用宿主）中表达猪源Mb，并在绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中表达牛源Mb。通过免疫印迹法评估Mb积累量，发现烟草（占总可溶性蛋白（total soluble protein，TSP）的2.7%）和生菜（占TSP的1.5%）中的积累量远高于莱茵衣藻（

　　传统畜牧业是资源密集型且涉及伦理争议的生产方式，其显著贡献于温室气体排放、森林砍伐和生物多样性丧失。随着全球人口增长、气候变化和作物病害对粮食安全造成的压力日益增大，开发可持续的替代蛋白来源成为迫切需求。肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是一种17 kDa的氧储存血红素蛋白，存在于脊椎动物心肌和骨骼肌中，由单条多肽链折叠成八个α螺旋构成，结合一个b型血红素。血红素中的铁离子可形成六个配位键，其中四个与卟啉环氮原子结合，一个与近端组氨酸（H93）结合，另一个与氧等配体结合，该配体决定了肌肉及肉类的颜色。血红素也是生物可利用铁的重要来源，比植物中含量更高的非血红素铁更易被人体吸收。此外，Mb在赋予肉类“金属味”和鲜味方面起关键作用，因此是使肉类替代品具有类肉特性的重要产品。目前，Mb已在多种异养生物中表达，如大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但异养蛋白生产在可扩展性方面受限，且依赖昂贵且耗能的生物反应器和原料。在植物中，已有通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）递送病毒载体在本氏烟叶片中瞬时表达Mb的报道，但瞬时表达在可持续食品蛋白生产中的可扩展性受限。叶绿体转化技术相比核转化具有转基因高表达（源于叶绿体的原核祖先）、高拷贝数、无基因沉默机制等优势，且由于母系遗j9.com传和同源重组整合到特定位点，转基因环境扩散受限且无位置效应。叶绿体也是血红素（Mb的辅基）合成的场所，其四吡咯途径与叶绿素、西罗血红素和光敏色素胆素共享。此前仅有一例关于绿藻莱茵衣藻叶绿体转化表达牛源Mb的报道，但积累量仍显著低于动物肉。目前尚无高等植物稳定转化积累Mb的文献报道。

　　研究人员采用叶绿体转化技术，在模式植物烟草（Nicotiana tabacum）和可食用作物生菜（Lactuca sativa）中稳定表达猪源Mb，并在莱茵衣藻叶绿体中表达牛源Mb。同时，研究人员还通过核转化（使用花椰菜花叶病毒35S启动子或拟南芥泛素10启动子）表达猪源Mb作为比较。研究评估了Mb积累水平，纯化并分析了Mb的血红素结合、氧化损伤和蛋白折叠情况，并测定了表达血红素结合蛋白对光合性能和植物体内血红素水平的影响。

　　研究使用了以下主要技术方法：（1）Golden Gate组装构建叶绿体转化载体，使用物种特异性同源臂靶向psaB或psbA位点；（2）生物弹射法（biolistic bombardment）转化烟草、生菜和莱茵衣藻叶绿体；（3）Southern blot和全基因组测序确认同质化（homoplasmy）状态；（4）SDS-PAGE和免疫印迹（immunoblotting）结合光密度分析定量Mb蛋白积累；（5）阴离子交换层析和尺寸排阻层析纯化Mb；（6）液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析蛋白质量和翻译后修饰；（7）圆二色谱（CD）分析蛋白折叠；（8）吡啶血色原法测定血红素结合率；（9）脉冲振幅调制（PAM）荧光仪测定光合参数；（10）辣根过氧化物酶法测定总血红素含量。

　　针对每个生物体设计了Mb表达载体。烟草载体pAG108基于pKP9，插入psaB基因座，使用烟草核糖体RNA操纵子启动子（j9.comPrrn）和细菌U0序列作为合成5UTR驱动猪源Mb表达。生菜载体pAG115使用内生psbA启动子和5UTR。衣藻载体pAG102使用16S rRNA启动子和psaA 5UTR，靶向psbA位点。通过生物弹射法转化后，Southern blot和基因组测序确认烟草和生菜转化体为同质化状态，衣藻通过PCR确认。获得的转化体具有正常形态，能产生可育花朵和功能性种子，种子在含选择剂的培养基上存活，证明转化稳定性。烟草和生菜种子试验显示转基因后代在含壮观霉素和链霉素培养基上无分离，符合叶绿体转化预期。Nt-pAG108种子发芽效率93±4.4%，漂白效率0%；Ls-pAG115种子发芽效率81.5±2.0%，漂白效率0%。在土壤中生长时，转基因烟草株系Nt-KP9和Nt-pAG108与野生型相比表现出生长迟缓表型，但无生长停滞。

　　SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示，烟草和生菜转基因植物叶片总可溶性蛋白（TSP）中出现17 kDa额外条带，免疫印迹确认其为Mb。通过光密度分析，猪源Mb在烟草中积累量约为TSP的2.8%，在生菜中约为1.5%。重复实验验证烟草中积累量为2.6% TSP。作为比较，使用花椰菜花叶病毒35S启动子和拟南芥泛素10启动子的核转化烟草，在37个核转化株系中，猪源Mb积累量始终低于叶绿体转化株系（至少低3倍）。莱茵衣藻中Mb积累量估计低于TSP的0.25%，远低于烟草和生菜，且免疫印迹中出现双条带，可能为Mb降解产物。

　　由于烟草中积累量更高，研究人员从烟草叶片中通过阴离子交换层析和尺寸排阻层析纯化猪源Mb，获得高纯度样品。LC-MS分析显示主要峰质量为16,953 Da，对应去除起始甲硫氨酸的预期大小（全长为17,085 Da），这是叶绿体中常见的翻译后修饰（PTM）。另外两个次要峰分别为17,085 Da（保留起始甲硫氨酸的Mb）和17,161 Da（可能为污染物或PTM）。LC-MS显示蛋白质几乎没有氧化损伤。光谱分析显示409 nm处吸收峰，表明存在高铁肌红蛋白（metmyoglobin，Fe3?状态），但409/280 nm峰比约为1.5，低于大肠杆菌表达Mb的4，表明样品中存在大量脱辅基Mb（apo-Mb，未结合血红素）。吡啶血色原法测定血红素结合率约为35%，而大肠杆菌表达Mb的血红素结合率为80%。圆二色谱（CD）显示典型的α螺旋模式，与正确折叠的Mb一致。

　　研究者讨论指出，从烟草叶片纯化的猪源Mb在大小、折叠和血红素结合方面与其它哺乳动物Mb相似。LC-MS表明主要形式缺乏起始甲硫氨酸，这是Mb常见的PTM，也发生在猪等哺乳动物中。去除起始甲硫氨酸对整体折叠影响很小，对血红素口袋几乎无影响。LC-MS还表明蛋白质几乎没有氧化损伤。CD确证Mb为α螺旋蛋白的正确折叠。然而，仅35%的Mb结合了血红素，这可能是因为外源血红素蛋白的表达超过了内源血红素生物合成途径的能力，与叶绿素生物合成竞争共享的四吡咯前体，以及血红素插入apo-Mb效率低下。血红素供应不足不仅降低holo-Mb形成，还可能限制整体Mb积累，因为血红素对蛋白质稳定性和正确折叠很重要。提高血红素积累的策略包括过表达亚铁螯合酶1（FC1）或补充氨基乙酰丙酸（ALA）等前体。光合参数分析表明，Mb表达未影响光合过程，这是首次证明烟草叶绿体中血红素蛋白表达对生长和光合性能无显著影响。生长延迟在Nt-pAG108和空载体对照Nt-pKP9中均观察到，表明插入位点可能并非完全中性。叶绿素含量增加也可能与插入位点选择有关。干重产量方面，烟草为800±110 mg/kg，生菜为810±60 mg/kg，高于莱茵衣藻报道值（234 mg/kg干重），但仍低于动物肌肉（牛腰肌干组织8.10 mg/g，牛最长肌11.16 mg/g），相差约10倍。然而，植物种植的资源效率远高于畜牧业，因此植物来源Mb每公顷蛋白产量可能媲美甚至超过畜牧业。核表达积累量低于叶绿体表达，与文献中人类生长激素（hST）的比较结果一致。总血红素水平升高两倍，部分可由Mb表达解释，但仅35%血红素结合，表明血红素供应是瓶颈。该研究首次报道了高等植物中稳定Mb积累，也是首次在生菜中异源表达血红素蛋白。植物生产重组蛋白具有高可扩展性、可持续性和无人类病原体等优势，使用可食用非致敏宿主如生菜可减少纯化步骤和监管障碍。但微生物系统目前拥有更成熟的工业发酵基础设施和更可预测的产量。对于商业化，Mb表达水平需进一步优化，特别是提高血红素结合率。