j9控股有限公司（九游会j9.com）官网 - 替代蛋白领军者

　　1.一种植物免疫激活蛋白，其特征在于：所述植物免疫激活蛋白的氨基酸序列如SEQ

　　2.一种用于编码如权利要求1所述的植物免疫激活蛋白的基因，其特征在于：所述编码

　　3.一种用于扩增如权利要求2所述的基因的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列

　　4.一种如权利要求1所述的植物免疫激活蛋白或如权利要求2所述的基因在防治植物

　　5.如权利要求4所述应用，其特征在于：所述病害为由群结腐霉菌、大豆疫霉菌或核盘

　　6.如权利要求4所述应用，其特征在于：所述植物病害包括生姜茎基腐病或大豆疫病。

　　7.一种农药组合物，其特征在于：所述农药组合物包含如权利要求1所述的植物免疫激

　　8.如权利要求7所述农药组合物，其特征在于：所述农药组合物还包含精甲霜灵和咯菌

　　9.一种农药制剂，其特征在于：所述农药制剂包含如权利要求1所述的植物免疫激活蛋

　　10.如权利要求9所述的农药制剂，其特征在于：所述植物免疫激活蛋白的浓度范围为

　　本发明属于农作物生物防治技术领域，具体涉及一种植物免疫激活蛋白PmSCR1及

　　死体营养菌，寄主范围十分广泛，且双子叶及单子叶植物均可侵染，主要包括：大豆、花生、

　　番茄、洋葱和生姜等等，可造成多种植物的根腐病及茎基腐病(Daly et al.,2021)。其中，

　　等多种生物学活性，有很高的经济利用价值，在热带及亚热带地区广泛种植(Mao et al.,

　　2019)。我国是全球生姜种植面积最大且生产总量最多的国家，然而，近些年随着我国生姜

　　的规模化种植，由群结腐霉菌引起的生姜茎基腐病发生越来越频繁，危害也日益加重，极端

　　环境下，发病田块减产50％‑80％，甚至绝收，严重制约了我国生姜生产(Daly  et  al .,

　　2021)。目前对该病害的防治主要依赖化学农药，然而使用大量化学药剂，极易引发一系列

　　膜表面，可识别来自入侵病原菌的分子模式(molecular  patterns)，进而激活植物自身的

　　基础免疫反应，从而保护自己(Ngou  et  al.,2021)。这些能够激活植物免疫反应的分子模

　　式又被称为植物免疫激发子(plant  immunity  inducer)，通常是一类在微生物中非常保守

　　的物质如：多肽、蛋白、寡糖、脂质等(Ngou  et  al.,2021)。近些年，随着植物免疫相关机制

　　的逐渐明晰，大量国内外研究人员聚焦于植物免疫激发子的鉴定，以期为植物病虫害的防

　　研究表明，病原菌分泌的一类分子量小、富含半胱氨酸的SCR(Small  cysteine‑

　　rich)蛋白，可作为植物免疫激发子在病原菌侵染植物过程中扮演重要角色(Rocafort  et

　　al .,2020)，也被称为植物免疫激活蛋白。例如：由卵菌病原菌致病疫霉菌(Phytophthora

　　infestans)分泌的SCR蛋白‑PsPC2，可被植物蛋白酶切割，释放免疫抗原肽诱导茄科植物产

　　应(Wang  et  al.,2020)；然而，腐霉菌中SCR蛋白的功能及机制研究暂未见报道。

　　种新的植物免疫激活蛋白并将其命名为PmSCR1，该植物免疫激活蛋白具有较强的活性，能

　　诱导植物的防御反应，可应用于农作物的病害防治，特别是针对由群结腐霉菌、大豆疫霉菌

　　列如SEQ  ID  NO.2所示；或所述植物免疫激活蛋白为将SEQ  ID  NO.2的氨基酸序列经过一个

　　或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物抗性相关的由SEQ  ID  NO.2衍生

　　本发明还提供了一种用于扩增上述基因的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ  ID

　　在本发明的一些实施方式中，所述植物免疫激活蛋白的浓度范围为0.1～10mg/L。

　　本发明的实施例至少具有以下有益效果：本发明的植物免疫激活蛋白PmSCR1能够

　　诱导植物免疫反应，具有较强的诱抗活性，可以应用于农作物的病害防治，例如用于由群结

　　腐霉菌、大豆疫霉菌以及核盘菌引起的植物病害的防治，特别是针对生姜茎基腐病的防治；

　　该植物免疫激活蛋白为群结腐霉菌中SCR类植物免疫诱抗蛋白，不仅为揭示群结腐霉菌与

　　植物的互作机制奠定基础，同时，为开发能够激活植物免疫的蛋白类生物农药提供新的蛋

　　图1为本发明实施例3中注射了相应农杆菌菌液，且培养7天后的本氏烟叶片照片；

　　图3为本发明实施例4中过表达GFP及PmSCR124  h后接种群结腐霉菌的发病情况及

　　图4为本发明实施例4中过表达GFP及PmSCR124  h后接种核盘菌的发病情况及病斑

　　图8为本发明实施例7所述PmSCR1诱导本氏烟抗性相关基因表达的定量PCR检测结

　　图9为本发明实施例8中注射PmSCR1纯化蛋白24h后接种群结腐霉菌的发病情况及

　　图10为本发明实施例8中喷施PmSCR1纯化蛋白24h后接种大豆疫霉菌36h的发病情

　　图11为本发明实施例8中注射PmSCR1纯化蛋白24h后接种核盘菌的发病情况及病

　　充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施

　　例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前

　　等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料(例如，从常规生化试剂公司订购)。

　　本发明实施例中所涉及的引物均由北京擎科生物科技有限公司南京分公司合成。实施例中

　　未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所述技术、条件或产品(试剂盒或试剂)

　　本实施例所用群结腐霉菌为SWQ7菌株，为本实验室于2018年至2019年从全国7个

　　省份的患病生姜块茎上分离所得，目前保存于江苏省农业科学院植物保护研究所，此外，还

　　前期研究完成了SWQ7的全基因组测序以及SWQ7侵染生姜不同时间点的转录组测

　　序，本实施例基于上述组学数据，经过生物信息学分析，挑选含有信号肽序列、不含跨膜结

　　构域、不含已知功能结构域且在SWQ7侵染生姜过程中上调表达的47个候选分泌蛋白。

　　本实施例中将上述47个候选分泌蛋白编码基因分别构建至pSuper‑HA载体上，并

　　在本氏烟叶片上瞬时表达，结果发现其中一个具有植物免疫激活活性，将其命名为PmSCR1。

　　编码植物免疫激活蛋白PmSCR1的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示；植物免疫激活

　　以侵染SWQ7的本氏烟叶片为材料，按照KK超快植物总RNA提取试剂盒(庄盟，

　　ZP405K)说明书操作提取总RNA，利用分光光度计检测其含量和质量。取1μg上述总RNA为模

　　根据SEQ  ID  NO.1所示的PmSCR1编码基因序列，设计了如下PCR扩增引物序列：

　　以步骤1所得cDNA为模板，上述引物序列为扩增引物，使用诺唯赞高保线×Phanta  Max  Master  Mix(P520)按照说明书操作，完成PmSCR1编码基因的扩增。琼脂

　　糖凝胶上进行电泳分离，并利用DNA凝胶回收试剂盒(擎科，T‑GE0101)对目的条带进行回

　　方法将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布至含50μg/mL卡那霉素抗生素

　　的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑取阳性克隆送至北京擎科生物科技有限公司南京分

　　公司测序，j9.com测序结果与SEQ  ID  NO.1序列一致的克隆，利用高纯度质粒DNA小量提取试剂盒

　　(擎科，T‑PM0201)按照说明书操作提取质粒，用于后续实验，以下称为实施例2质粒。

　　将实施例2所得质粒，利用冷激转化方法转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，挑取

　　经PCR验证的阳性克隆，接种至5mL含50μg/mL卡那霉素及50μg/mL利福平抗生素的LB液体培

　　养基中，28℃、220rpm培养过夜，取1mL培养菌液与1mL  50％甘油混匀，‑80℃长期保存以备

　　另外，同样的方法获得并保存阳性对照克隆—转染了pSuper‑INF1‑HA及阴性对照

　　分别将实施例3克隆和对照克隆在同时含50μg/mL卡那霉素及50μg/mL利福平抗生

　　素的LB液体培养基中，28℃、220rpm培养过夜。5000g，3min收集菌体，用缓冲液(10mM

　　片背面，25℃12h光照/12h黑暗条件下培养。3天后观察结果，7天后拍照，并统计结果。

　　烟叶片。如图1所示，与阴性对照GFP相比，阳性对照INF1和PmSCR1均可诱导明显的过敏性坏

　　分别收集注射并培养36h的本氏烟叶片样品，进行蛋白质表达情况检测。具体操

　　作：将收集的本氏烟叶片样品用液氮速冻后研磨至粉末状，迅速转移至80μL  RIPA裂解液

　　P0015)，混合均匀后沸水浴5min。取10μL样品在SDS‑PAGE凝胶中进行电泳分离。反应结束后

　　利用eBlot  L1快速湿转仪(金斯瑞，L00686C)将蛋白样品转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉

　　参见图2，Western  blot检测结果显示，GFP及PmSCR1基因在瞬时表达体系中可以

　　本实施例对植物免疫激活蛋白PmSCR1编码基因在本氏烟中瞬时表达可诱导本氏

　　1L，121℃高压灭菌15min)，25℃培养备用。将核盘菌接种至PDA固体培养基(200g去皮马铃

　　薯，切小块加水煮沸20‑30min，用四层纱布过滤后加入20g葡萄糖，15g琼脂粉，定容至1L，

　　以GFP为阴性对照，在本氏烟叶片上瞬时表达PmSCR1  24h后，接种群结腐霉菌菌块

　　(直径约5mm)，24h后紫外灯下观察发病情况并拍照。同时，按照相同的方法过表达PmSCR1

　　参见图3，过表达PmSCR1基因后接种群结腐霉菌，j9.com其发病面积明显小于过表达GFP，

　　参见图4，过表达PmSCR1基因后接种核盘菌，其发病面积明显小于过表达GFP，说明